逆转录聚合酶链反应（RT

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种核心分子技术，旨在检测和定量总RNA或信使RNA（mRNA），具有高灵敏度和准确性。在这个标准PCR过程的改进版本中，作为初始模板的mRNA首先被反转录为互补DNA（cDNA），然后通过PCR扩增用于下游分析。相对于其他检测mRNA的技术，如Northern印迹分析、RNA酶保护分析或原位杂交，RT-PCR在检测任何基因的RNA转录物时，其相对丰度如何，都明显更为稳定。因此，RT-PCR被广泛用于定量研究基因表达、检测转录变体以及生成用于克隆和测序的cDNA模板。

逆转录聚合酶链反应原理

为了将PCR应用于RNA的研究，RNA样品必须首先使用酶逆转录酶进行逆转录过程以生成cDNA。这种RNA依赖性DNA聚合酶在逆转录引物、脱氧核苷酸（dNTPs:dATP、dTTP、dGTP和dCTP）和酶辅因子的协助下，催化从其各自的靶RNA序列合成cDNA。然后将得到的cDNA用作PCR扩增的模板，根据反转录和PCR的执行方式，该过程可分为一步RT-PCR或两步RT-PCR。

视频1 演示逆转录聚合酶链反应关键步骤的动画视频教程：（1）逆转录，（2）变性，（3）引物退火，（4）引物延伸

表1 用于PCR、实时PCR和逆转录PCR的脱氧核苷酸（dNTPs）

 一步法RT-PCR

在一步RT-PCR中，反转录（即cDNA合成）和PCR在同一反应容器和缓冲液中进行。这种简单方便的单管设计在进行少量分析时效果良好，适用于高速、高通量应用。在一步RT-PCR中，需要序列特异性引物来指导cDNA的合成和扩增。由于特定引物比随机引物更容易在更高的反应温度下退火，因此在使用这种方法时，好利用具有高热稳定性的逆转录酶。

虽然一步RT-PCR方法有几个优点，但也有一些需要注意的地方。由于反转录和PCR都发生在同一试管中，因此不能单独优化反应条件，这可能会在不同程度上影响产率或反应效率。此外，由于所有合成的cDNA在随后的PCR步骤中被消耗，因此需要额外的原始RNA样本小份以重复反应或评估其他基因的表达。

图1 一步RT-PCR步骤

一步法RT-PCR的优缺点及应用

两步法RT-PCR

在两步RT-PCR中，逆转录和PCR在具有不同缓冲液、反应条件和启动策略的单独反应容器中进行。两步RT-PCR使用随机六聚体、低聚dT引物和基因特异性引物的混合物进行，提供样本中所有RNA物种的完整cDNA档案，而不是像一步法那样仅使用基因特异性引物。此外，反转录和PCR的解偶联允许对每个反应进行单独优化，以获得大效率和序列。这允许在反转录过程中获得更高的cDNA产量，并为cDNA样本的储存提供了机会，以供将来的扩增反应或下游应用。

虽然两步RT-PCR具有高灵敏度，但与一步RT-PCR相比，它更耗时，更不适合于高速、高通量的应用。它需要额外的开管步骤、更多的移液管和样品处理，这会增加可变性和污染风险。

图2 两步RT-PCR步骤

两步法RT-PCR的优缺点及应用

RT-PCR扩增产物的检测

在RT-PCR中，有两种主要的方法可以检测扩增子的产生。第一种方法在所有PCR循环完成后分析扩增子扩增，称为终点RT-PCR。第二种方法在PCR循环过程中实时测量扩增子浓度，称为实时RT-PCR或定量RT-PCR（RT-qPCR）。在RT-qPCR中，几种不同类型的化学试剂可用于实时检测扩增子的产生，包括Helixyte 绿色、分子信标和TaqMan探针。

终点RT-PCR

终点 RT-PCR 分析基于 PCR 反应的平台期，用于在 PCR 反应的所有循环完成后分析扩增产物。在此方法中，扩增子通过琼脂糖凝胶电泳分离，并使用 DNA 结合染料（如溴化乙锭 (EtBr)）进行检测，以确定 500 至 30,000 bp 范围内的 DNA 分子大小。虽然 EtBr 是常用的 DNA 染料，但它具有致突变性和吸入毒性。相反，请考虑使用更、更环保、的替代品，例如 Gelite X100（货号 17706）、Helixyte Green（货号 17590）、Helixyte Gold（货号 17595）、Gelite Green（货号 17589）或 Gelite Orange（货号 17594）。

终点RT-PCR的优缺点及应用